Un nouveau dispositif de pulvérisation aide les chercheurs à capturer les processus cellulaires à évolution rapide

Les cellules sont les unités de base de la vie, mais bon nombre de leurs processus fondamentaux se déroulent si rapidement et à des échelles si petites que les outils et méthodes scientifiques actuels ne peuvent pas suivre, ce qui nous empêche de développer une compréhension plus approfondie.

Aujourd'hui, des chercheurs du SLAC National Accelerator Laboratory, de l'Université de Stanford, de l'Université Cornell et d'autres institutions ont développé une nouvelle approche pour observer le déroulement des processus biologiques fondamentaux. L’approche, qui combine des microscopes électroniques cryogéniques avec des méthodes développées en cristallographie aux rayons X, pourrait conduire à de meilleurs médicaments et à une compréhension plus approfondie de la division cellulaire, de la photosynthèse et des interactions hôte-pathogène, entre autres sujets.

Leur étude est publiée dans la revue Biologie moléculaire de la cellule.

“De nombreux processus cellulaires se produisent à l'échelle de la milliseconde”, a déclaré Pete Dahlberg, scientifique et co-auteur de l'article. “Grâce à notre nouvelle technique, nous pouvons piquer une cellule, puis choisir le moment où nous voulons prendre une image claire de sa réponse.”

Réinventer un outil de pulvérisation puissant

Pendant de nombreuses décennies, les scientifiques se sont appuyés sur des techniques d’imagerie connues sous le nom de microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) et de tomographie électronique cryogénique (cryo-ET) pour voir l’intérieur des cellules, des protéines et d’autres organismes et molécules. Les deux techniques utilisent des microscopes électroniques pour capturer des instantanés d’échantillons congelés, qui ont révélé des structures cellulaires avec des détails extraordinaires.

Ces approches consistent à placer un échantillon sur un petit disque mince appelé grille de microscopie électronique et à le plonger dans un liquide cryogénique pour le congeler très rapidement. C’est très bien pour préserver les échantillons cellulaires dans leur état natif, mais les instantanés figés ne disent pas grand-chose aux chercheurs sur la dynamique. C’est un peu comme essayer d’apprendre des pas de danse en prenant des images aléatoires de quelqu’un qui danse.

Actuellement, dans des expériences cryo-ET similaires, les chercheurs mélangent manuellement des échantillons de cellules afin d’en prendre des images en réponse à des stimuli. Mais le mélange à la main prend du temps, un peu comme mélanger la pâte à crêpes à la main plutôt qu'avec un batteur électrique, ce qui signifie que les expérimentateurs ne peuvent observer les changements dans un organisme qu'à environ dix secondes d'intervalle, soit des centaines de fois plus longtemps que ne le prennent de nombreux processus importants.

“Lorsque vous mélangez et congelez manuellement des cellules dans des expériences cryo-ET, vous êtes souvent trop lent pour capturer les changements qui vous intéressent vraiment. Cela peut limiter votre capacité à comprendre des processus biologiques importants”, a déclaré Cali Antolini, chercheur au SLAC et co-auteur de l'article. dit.

Les chercheurs se sont donc tournés vers un dispositif de buse de pulvérisation souvent utilisé dans les installations de laser à électrons libres à rayons X (XFEL) et de synchrotron pour mélanger des échantillons destinés à des expériences de cristallographie. Le dispositif, connu sous le nom de buse virtuelle dynamique à gaz couplée à un injecteur mélangeur (GDVN), est souvent utilisé pour étudier les mouvements moléculaires qui se produisent sur des échelles de temps extrêmement courtes, comme des femtosecondes après l'activation avec la lumière ou sur des échelles de temps de la milliseconde à la seconde en utilisant un mélange chimique, à des XFEL comme Source de lumière cohérente Linac (LCLS) du SLAC.

“Le dispositif de pulvérisation du LCLS permet aux chercheurs d'observer les mouvements des atomes dans les microcristaux”, a déclaré Dahlberg. “Mais à mon avis, pulvériser des échantillons de microcristaux et pulvériser des échantillons de cellules est la même chose.”

“Nous voulions combiner autant que possible les techniques de source lumineuse et de cryo-ET”, a déclaré Soichi Wakatsuki, professeur et co-auteur principal du SLAC et de Stanford. “Nous savions que cela serait fructueux pour le développement de la microbiologie et de la médecine.”

Avec leur nouvelle approche, les chercheurs ont pulvérisé et congelé des échantillons de cellules qui avaient été mélangés à un stimulant en quelques millisecondes, au lieu de 10 secondes, le temps que prend le mélange manuel. Cela a permis aux chercheurs de prendre des images de l’échantillon cellulaire toutes les 25 millisecondes et de constater les changements sur cette échelle de temps.

“Notre nouvelle approche a permis d'identifier et de caractériser certains des changements morphologiques intéressants dans les cellules que nous avons commencé à observer au cours de nos expériences résolues dans le temps”, a déclaré Jacob Summers, étudiant diplômé de l'Université de Stanford et co-auteur de l'article.

Du jet à la brume

Des chercheurs de l'Université Cornell ont repensé la buse de pulvérisation du LCLS pour qu'elle fonctionne pour l'expérience cryo-ET. Mais ce n’était pas aussi simple que de faire passer le dispositif de pulvérisation du LCLS à une machine cryo-ET. Le problème était que, au LCLS, les échantillons sont pulvérisés dans un jet puissant, comme un tuyau d'arrosage fixé sur un jet. Cette force et cette pression ne fonctionneraient pas pour les expériences cryo-ET car les échantillons sont pulvérisés sur une surface de grille fine et fragile, qui se briserait probablement sous la force d'un courant-jet.

Par conséquent, les chercheurs ont ajusté le débit de gaz à travers la buse, un peu comme si on changeait le réglage d’un tuyau d’arrosage du jet au brouillard. Avec cet ajustement, ils ont créé une fine pulvérisation plutôt qu’un jet puissant.

Puisqu'il s'agissait d'une technique relativement nouvelle, les conditions correctes pour créer un spray brumeux étaient pratiquement inexplorées, a déclaré Kara Zielinski, chercheuse à Cornell et co-auteur de l'article. Ils ont dû tester de nombreuses conditions expérimentales différentes, comme le débit de liquide, le débit de gaz, la distance entre le pulvérisateur et la grille et même le type de grille, pour trouver les conditions optimales pour des grilles et une collecte de données de haute qualité, a-t-elle déclaré.

Les chercheurs ont également varié les débits de solutions cellulaires et stimulantes dans le dispositif de pulvérisation, contrôlant ainsi la vitesse à laquelle un échantillon se mélange et déclenchant l'horloge des réactions cellulaires que les chercheurs souhaitent étudier.

Maintenant que les chercheurs ont prouvé cette nouvelle technique, elle pourrait être appliquée à une grande variété de questions sur la dynamique structurelle au niveau cellulaire, a déclaré Zielinski.

“C'est toujours passionnant de faire partie du début d'une nouvelle méthode car cela signifie souvent ouvrir de toutes nouvelles voies de questions biologiques”, a-t-elle déclaré. “Les opportunités sont infinies car nous pouvons désormais déclencher la dynamique cellulaire en mélangeant de petites molécules et capturer des preuves structurelles directes de ses effets.”

“Je suis très enthousiasmé par les résultats que cette méthode pourrait apporter à l'avenir”, a déclaré Joey Yoniles, co-auteur de l'article et étudiant diplômé de l'Université de Stanford. “Même si nous considérons simplement les bactéries comme nous l'avons fait dans cette étude, nous pourrions examiner l'interaction entre les bactéries et les médicaments à une résolution extrêmement élevée.”