De nouvelles connaissances sur les « états sombres » fluorescents éclairent les voies à suivre pour une imagerie améliorée

Les scientifiques de l'hôpital de recherche pour enfants St. Jude ont signalé un moyen d'améliorer les mesures de distance à l'échelle moléculaire en utilisant le transfert d'énergie par résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET). smFRET quantifie les propriétés d'excitation et d'émission de produits chimiques appelés fluorophores. Les résultats ont été publiés dans Méthodes naturelles.

Lorsqu'un électron excité dans le fluorophore se détend, il émet de la lumière après un certain temps, provoquant une lueur (fluorescence) de la molécule. Cependant, les fluorophores ne deviennent pas toujours fluorescents après excitation. Au lieu de cela, grâce à des processus de mécanique quantique liés à l’état de « spin » de l’électron excité, ils peuvent entrer dans des états sombres triplets de longue durée qui ne produisent pas de fluorescence.

Cela réduit la sensibilité et la précision des mesures smFRET. En contrôlant la durée des états sombres grâce à des technologies « d’auto-guérison », les scientifiques de St. Jude montrent désormais que les états sombres triples peuvent être fortement atténués.

Cette avancée augmente considérablement la résolution de la méthode pour faire progresser le domaine de l’imagerie moléculaire.

smFRET capture des moments moléculaires éphémères

Capturer le battement d'ailes d'un colibri nécessite des caméras spécialisées avec une fréquence d'images élevée et un éclairage qui évite le flou des mouvements rapides. Visualiser le vol d'un colibri n'est rien en comparaison des défis liés à la capture des fonctions des biomolécules dans notre corps.

Les biomolécules sont plus petites que la longueur d’onde de la lumière (de l’ordre d’un milliardième de pouce) et leurs fonctions sont liées à leur mouvement, changeant de position ou de forme (conformation) des centaines à des milliers de fois par seconde.

Mesurer ces dynamiques éphémères est essentiel pour vraiment comprendre comment les molécules remplissent leurs fonctions, comment ces fonctions sont perturbées en cas de maladie et comment les thérapies médicamenteuses modifient leurs activités. smFRET, une technique d'imagerie moléculaire, est un moyen puissant de visualiser directement comment les biomolécules se déplacent en temps réel et à l'échelle d'une molécule unique.

À St. Jude, Scott Blanchard, Ph.D., départements de biologie structurale et de biologie chimique et thérapeutique, fait progresser le domaine de l'imagerie smFRET. Les efforts du laboratoire Blanchard, par l’intermédiaire du St. Jude Single-Molecule Imaging Center, ont été essentiels à la conception et au développement de fluorophores permettant des mesures à l’échelle moléculaire.

“Les molécules fluorescentes les plus courantes et les plus largement utilisées ne sont généralement pas à la hauteur de la tâche de quantification des événements à l'échelle moléculaire. Cela nous a amenés à relever le défi de synthétiser nos propres fluorophores”, a déclaré Blanchard. “Ce faisant, nous avons réalisé que la photophysique fondamentale de la fluorescence devait être modifiée.”

Pour mener des expériences smFRET, les chercheurs placent des fluorophores sur deux points d'une biomolécule. Lorsqu'un laser est dirigé vers le premier de ces fluorophores (le donneur), un électron qu'il contient gagne cette énergie et devient excité.

Lorsque l’électron se détend, cette énergie est transférée à travers l’espace jusqu’au deuxième fluorophore (l’accepteur), mais seulement s’il est proche du donneur. En enregistrant et en quantifiant les éclats fluorescents des fluorophores donneurs et accepteurs, les distances peuvent être mesurées de l’ordre d’un milliardième de pouce.

Chaque élément d’information est essentiel à la compréhension de la fonction et du dysfonctionnement biologiques. Cependant, une utilisation correcte de la technique nécessite une navigation minutieuse dans les propriétés fondamentales de la fluorescence.

Le spin flip électronique se verrouille dans un état triplet

Les règles régissant l’émission de lumière d’un fluorophore tournent autour du spin électronique. Lorsqu’un électron excité se détend, il devrait revenir à son état d’origine, en conservant son état de spin ou son nombre quantique de spin. Toutefois, cela n’arrive pas toujours.

“Chaque fois qu'un électron est excité, il y a une probabilité qu'il perde la mémoire de son spin et adopte un état de spin inversé”, a déclaré Blanchard, auteur correspondant de l'étude. Méthodes naturelles étude.

“Bien que ce processus soit relativement rare, avec une probabilité d'environ 1 sur 100, s'il change d'état de spin, il se retrouve alors dans cet état triplet à durée de vie 100 000 fois plus longue qui ne produit pas de fluorescence. Par conséquent, le fluorophore devient beaucoup plus sombre que il pourrait en être autrement.

“Le domaine de la fluorescence est confronté à ce problème depuis des années”, a ajouté Blanchard. “Dans le contexte du FRET, nous avons remarqué que les accumulations d'états triplet changent avec l'intensité de l'éclairage et varient selon les fluorophores.”

FRET exige que les fluorophores donneurs et accepteurs se comportent de la même manière. Mais comme la technique nécessite d’exciter directement l’un et non l’autre, lorsque vous allumez le laser, les états triplet du donneur et de l’accepteur sont occupés à des rythmes différents.

“Vous vous retrouvez avec un processus qui donne le mal de mer, dans lequel le donneur et l'accepteur plafonnent à des niveaux différents, de sorte qu'ils perdent leurs performances à des degrés différents”, a expliqué Blanchard. “Les lectures expérimentales deviennent variées, entraînant une réduction de la qualité et de la fiabilité des données d'imagerie. Cela restreint fondamentalement les limites de résolution spatiale et temporelle des mesures smFRET.”

Un objectif clé des études d’ingénierie des fluorophores est donc de réduire autant que possible la durée de vie des états triplets. C'est l'objectif fondamental des technologies « d'auto-guérison ».

“Pour garantir des mesures de distance précises dans les données smFRET, le domaine s'appuie actuellement sur des étapes d'étalonnage qui ne prennent pas explicitement en compte les états triplet”, a expliqué Zeliha Kilic, Ph.D., co-premier auteur du Département de biologie structurale de St. Jude.

“Les technologies d'auto-réparation rapprochent le domaine des conditions optimales où les états triplets sont absents, garantissant ainsi que les étapes d'étalonnage utilisées donnent des résultats plus précis et donc des mesures de distance.”

Les fluorophores auto-réparateurs ouvrent la voie

Des produits chimiques appelés extincteurs à état triplet, tels que le cyclooctatétraène, neutralisent ce phénomène mais ont également tendance à encrasser les œuvres. “Le cyclooctatétraène est gras, présente des solubilités variées et faibles et est difficile à contrôler”, a déclaré Blanchard.

Des publications antérieures de l'équipe de Blanchard ont rapporté le développement de fluorophores avec du cyclooctatétraène directement attaché. Cette approche a résolu le problème de solubilité et a créé des fluorophores « auto-réparateurs » dans lesquels l'occupation de l'état triplet a été réduite jusqu'à 1 000 fois.

Dans la nouvelle étude, les chercheurs ont démontré que l’utilisation de fluorophores auto-cicatrisants comme donneurs et accepteurs dans les expériences smFRET améliore la qualité et la fiabilité des données et évite la perte de qualité d’imagerie à mesure que l’intensité du laser augmente. Ces améliorations repoussent les frontières du smFRET, et les technologies de fluorophores auto-réparatrices trouvent des applications de plus en plus diverses dans le monde entier.

“La luminosité et la photostabilité améliorées des fluorophores auto-réparateurs permettent d'améliorer considérablement la résolution spatio-temporelle de l'imagerie smFRET”, a déclaré le co-premier auteur Avik Pati, Ph.D., anciennement du département de biologie structurale de St. Jude, maintenant de Institut Birla de technologie et de science.

“Nous pouvons désormais quantifier de manière robuste la dynamique conformationnelle à l'échelle nanométrique au sein de biomolécules uniques en des millisecondes et à des concentrations physiologiques d'oxygène.”

Blanchard est convaincu que ces résultats aideront les chercheurs de St. Jude et la communauté scientifique au sens large. “Repousser les frontières des innovations en matière d'imagerie à St. Jude fait partie du plan stratégique de l'institution, et nous sommes convaincus que les fluorophores auto-cicatrisants joueront un rôle important dans l'atteinte de nos objectifs”, a-t-il déclaré.

“De plus, beaucoup bénéficieront probablement de ces progrès, car l'approche d'auto-guérison a montré son potentiel pour améliorer la plupart des applications de fluorescence.”